viernes, 29 de marzo de 2013

Técnicas que empleamos (Parte 1): Agroinfiltración



FUNDAMENTOS DE LA AGROINFILTRACIÓN

La agroinfiltración es la técnica que más ha contribuido a la popularización de N. benthamiana como planta modelo en la investigación, ya que posibilita que proteínas de interés se fusionen traduccionalmente a una proteína autofluorescente y se produzcan de forma transitoria en las células vegetales de una forma rápida y muy sencilla.
La agroinfiltración, que tan bien funciona en N. benthamiana, lamentablemente funciona de una forma muy pobre en Arabidopsis thaliana. Por ello no sólo ha aumentado el número de publicaciones científicas que emplean a N. benthamiana como única planta modelo, sino que además ha aumentado el número de publicaciones que emplean esta especie para completar los estudios iniciados en A. thaliana. Metodológicamente la agroinfiltración es el colmo de la simplicidad: Con una jeringuilla desechable de 1 ml (sin aguja) se inyecta una suspensión bacteriana (de Agrobacterium tumefaciens) en el espacio intercelular del envés de una hoja. La cepa bacteriana, que es un patógeno vegetal y de forma natural puede transferir material genético exógeno, contiene un vector binario diseñado para la expresión de la proteína de interés. Pasadas 24 ó 48h desde la infiltración en las hojas se puede recoger el tejido para su observación al microscopio o para emplearlo en análisis bioquímicos.

 Agrobacterium tumefaciens es un fitopatógeno que causa graves daños en las plantas superiores, en las que produce tumores o agallas en la base del tallo, siendo su tratamiento difícil y costoso. La infección la provoca Agrobacterium por medio del plásmido Ti o inductor de tumor. En el plásmido Ti se encuentra una región de DNA que se transfiere al núcleo de la célula vegetal y se inserta en su genoma a partir del cual se transcribe y se traduce. Esta región de DNA se denomina T-DNA o DNA de transferencia y está delimitada por secuencias repetidas de 25 pares de bases (bordes derecho e izquierdo) que orientan la región que será procesada. El T-DNA silvestre normal localizado en el plásmido Ti, tal como se observa en la siguiente figura, contiene genes de síntesis de hormonas que provocan un crecimiento descontrolado de las células vegetales (oncogenes) y genes de síntesis de opinas específicas de las que se nutren las bacterias.

Los genes vir se agrupan en diez operones que realizan cuatro funciones básicas: 1) Sensar los compuestos fenólicos que produce la planta tras sufrir una herida y llevar a cabo la transducción de dicha señal (VirA y VirG); 2) Procesar el T-DNA del plásmido y unirse covalentemente al extremo 5' de la monohebra de DNA procesada (VirD1 y VirD2); 3) Secretar la monohebra de DNA procesada y de las proteínas Vir (D2, D5, E2, E3 y F) mediante un sistema de secreción de tipo 4 (11 proteínas VirB y VirD4); 4) Participar en el tráfico citoplásmico de la monohebra de DNA dentro de la célula hospedadora e integración en el genoma de la misma (VirD2, VirD5, VirE2, VirE3, VirF). Sin embargo, ninguno de los genes codificados en el T-DNA es imprescindible para la transferencia del mismo. De ahí que haya sido posible construir vectores carentes de los genes de patogenicidad en los que se inserten genes de interés entre los bordes del T-DNA y que hagan uso de los genes vir para ser transferidos al genoma de la célula vegetal.

El sistema de vector binario nos permite aprovechar la capacidad de transferir los genes codificantes de las proteínas que deseamos expresar al genoma de la planta hospedadora, en este caso Nicotiana benthamiana, evitando la aparición de la enfermedad en la planta. En un vector binario que se emplea de forma generalizada para la transfección en plantas no existen ni los genes vir ni los genes para el catabolismo de opinas. Existen los bordes derecho e izquierdo del T-DNA pero se han suprimido los genes onc y ops, y en su lugar, introducimos el gen que deseamos expresar (DNA exógeno) y un gen marcador para seleccionar las plantas transformadas, normalmente un gen de resistencia a antibiótico o herbicida. El DNA exógeno puede contener información para una o varias proteínas. Éstas pueden dar lugar a una proteína de fusión o a varias proteínas independientes que forman parte de la misma ruta metabólica (Ver al respecto el artículo de van Herper et al., 2010, Nicotiana benthamiana as a production platform for Artemisinin precursors). La supresión de los genes onc y ops nos permite calificar al T-DNA como no oncogénico. El vector binario deberá contener, tal como se observa en la figura siguiente, el origen de replicación de A. tumefaciens y de E. coli para asegurar su estabilidad en ambas bacterias (la manipulación se lleva a cabo en E. coli por su mayor sencillez), y un gen marcador de resistencia bacteriana a antibióticos.


El material genético que se encuentra entre los bordes LB y RB del T-DNA (los genes codificantes de la proteína de fusión PRO:GFP y de la resistencia de la planta a Kanamicina o a Basta) no puede ser transferido al genoma de la célula vegetal debido a que el vector binario no contiene los genes vir, imprescindibles para este fin. Para solventar esta deficiencia, el plásmido binario se transforma en una cepa de A. tumefaciens desarmada del plásmido Ti. Esto significa que posee un plásmido Ti modificado, denominado helper, al que se le han eliminado los genes clave implicados en la patogenicidad y que, sin embargo, conserva los genes vir que permiten movilizar la región T-DNA del vector.  
Al sistema de vector binario también se le conoce como sistema trans porque el T-DNA no oncogénico y los genes vir se encuentran en plásmidos distintos. También existe el sistema cis o de vector cointegrado, menos empleado por la dificultad de manejo, en cuyo caso tanto el T-DNA no oncogénico como los genes vir se encuentran en el mismo vector. En tal caso el T-DNA no oncogénico se integra en el plásmido Ti (que contiene los genes vir) mediante recombinación homóloga. Para actualizar los aspectos relativos a la transformación de plantas con vectores binarios recomiendo el artículo de Lee & Gelvin (2008). Una vez en el núcleo de la célula vegetal, los genes incluidos en el T-DNA se transcriben normalmente dando lugar a la proteína de interés y a la resistencia correspondiente. La tecnología que permite aprovechar la maquinaria fitopatogénica que, de forma natural, posee Agrobacterium tumefaciens constituye la base de la obtención de numerosas plantas transgénicas, al permitir la transferencia de genes exógenos al núcleo de las células vegetales. De hecho, los vectores binarios son los que más han simplificado la generación de plantas transgénicas. Se han diseñado vectores binarios especializados en construcciones concretas que se introducen en cepas de Agrobacterium que contienen el plásmido helper. Entre estos vectores binarios se encuentran los que posibilitan la expresión de proteínas, observar la inducción de promotores, localización de proteínas, estudios de interacción entre proteínas, y silenciamiento génico inducido por RNA de interferencia (RNAi). Sin embargo, la simplificación en el uso de vectores binarios tiene un coste. Normalmente son vectores con múltiples copias, lo que da como resultado la integración de múltiples copias del T-DNA en el genoma de la planta. La presencia de múltiples copias del transgén da lugar al silenciamiento del mismo con más frecuencia que cuando se integra una sola copia. Otro de los problemas asociados a la transformación de plantas que se intensifica con el uso de vectores binarios multicopia es la integración del esqueleto del vector en el genoma.

Paréntesis: Silenciamiento génico post-transcripcional de RNA
Una vez que el T-DNA se ha incorporado al núcleo de las celulas de N. benthamiana comienza a transcribirse dando lugar a RNA que sale del núcleo al citoplasma de las células. En el citoplasma se encuentran los ribosomas, que son las máquinas que traducen el RNA derivado del T-DNA a proteínas. De este modo se consigue la expresión ectópica de la proteína de interés. Sin embargo, la utilidad del sistema es limitada porque la expresión ectópica de la proteína cesa al cabo de 2 ó 3 días. La razón de esta falta de eficiencia es el silenciamiento génico post-transcripcional (conocido de forma abreviada como PTGS, de Post-Transcriptional Gene Silencing) (Voinnet et al. 2003).

El silenciamiento génico post-transcripcional de RNA es un mecanismo de degradación de RNA específico de secuencia y que se encuentra muy conservado entre la mayoría de los eucariotas. El RNA transcrito de un gen determinado que resulta degradado no se puede traducir a la proteína correspondiente y queda, por tanto, silenciado. Mediante este sistema se degradan las moléculas de RNA extraño, ya sea procedente de un transgén con elevado nivel de expresión, de un gen aberrante, o de una infección vírica. De hecho, el silenciamiento de RNA es una respuesta de defensa vegetal dirigida a limitar las infecciones víricas y la severidad de sus síntomas (Johansen & Carrington 2001). En los diferentes organismos donde se ha estudiado el PTGS comienza con la formación de una molécula iniciadora: un RNA de doble hebra (dsRNA). El dsRNA se forma en los pasos intermedios de la replicación del genoma de muchos virus de plantas y, por ello, los virus son con frecuencia potentes inductores del silenciamiento de RNA. En el caso particular del RNA de un transgén, se requiere una RNA polimerasa vegetal dependiente de RNA (RDR) que catalice la síntesis del RNA complementario al del transgén. El dsRNA que se forma por la unión del RNA mensajero (mRNA) y de su RNA complementario es reconocido por una nucleasa específica de dsRNA (RNAsa de tipo III) que lo trocea en pequeños fragmentos de RNA, de 21-25 pb que se conocen como siRNAs, es decir,  small interfering RNAs. Estos siRNAs se asocian con proteínas de tipo nucleasa y sirven de guía por complementariedad de secuencia para la degradación del RNA del transgén y, en su caso, de otros mRNAs con elevada identidad de secuencia. En conclusión, el PTGS es un factor limitante del sistema de expresión transitoria de una proteína de interés en N. benthamiana mediada por Agrobacterium y, por supuesto, para los virus que provocan infecciones en plantas. No obstante, los virus han desarrollado una estrategia contra-defensiva, denominada inhibición del silenciamiento génico de RNA que, en esencia, consiste en bloquear algún paso del mecanismo de silenciamiento. En el siguiente esquema, tomado de Jiang et al. (2012), se pueden observar en rojo los distintos inhibidores de silenciamiento virales identificados y los pasos del silenciamiento génico de RNA que bloquean.


La inhibición (también denominada supresión) del silenciamiento génico es el "invento" de los virus de plantas que nosotros aprovechamos para favorecer en N. benthamiana la expresión de las proteínas de interés. Se han probado numerosos inhibidores de silenciamiento de origen viral a fin de determinar cuál es más efectivo y permite una mayor expresión de la proteína de interés. Actualmente el más utilizado es la proteína p19 de un virus de tomate (tomato bushy stunt virus, TBSV) que forma un homodímero que se une a la forma dúplex de los siRNAs bloqueando así la liberación de los siRNAs y, con ello, la degradación del RNA procedente del transgén. Estos siRNAs son los que se mueven a las células vecinas y promueven el silenciamiento sistémico. El bloqueo del movimiento local de los siRNAs por parte de p19 es esencial para que los virus lleven a cabo una infección sistémica. V2 es otro inhibidor de silenciamiento viral del que recientemente se ha observado que incrementa los niveles de expresión de transgenes en los ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana a un nivel parecido al de p19 (Naim et al. 2012). V2 es una proteína de otro virus de tomate (tomato yellow leaf curl virus) y actúa en otro nivel de la maquinaria de silenciamiento natural de las plantas. En síntesis, V2 interfiere con la amplificación secundaria de los siRNAs al interaccionar o bien directamente con la proteína SGS3 (una proteína que actúa de forma concertada con la RDR6 para la síntesis de la hebra complementaria al mRNA) de la planta o a las estructuras de dsRNA con extremos 5' implicadas en la generación de siRNAs. Una ventaja adicional del inhibidor de silenciamiento V2 es que permite la sobrexpresión de genes exógenos a N. benthamiana al mismo tiempo que posibilita el silenciamiento de genes endógenos mediante el sistema de las horquillas de RNAi. Este sistema es el método más comúnmente empleado para crear mutantes con pérdida de función en genes de interés y funciona de forma efectiva en las plantas mutantes sgs3.

El empleo de inhibidores de silenciamiento viral en la expresión transitoria de proteínas mediada por la infiltración con Agrobacterium es un método de expresión de proteínas en plantas que posee una gran eficiencia y fue desarrollado por el grupo de David Baulcombe del Sainsbury Laboratoy (Norwich, Reino Unido). Actualmente esta tecnología se encuentra patentada por Plant Bioscience Limited.

La implementación práctica del uso de inhibidores de silenciamiento en la agroinfiltración de N. benthamiana es muy sencilla. Basta con infiltrar en las hojas de N. benthamiana el cultivo de la cepa de Agrobacterium que lleva el sistema de vector binario para expresar las proteínas de interés junto con otro cultivo de la cepa de Agrobacterium que contiene el sistema de vector binario que expresa un inhibidor de silenciamiento génico de origen viral.


PROTOCOLO DE AGROINFILTRACIÓN

1º) Preparación del cultivo bacteriano que vamos a infiltrar en las hojas de N. benthamiana:

1.1) Crecimiento durante la noche a 28ºC y en agitación en medio YEP ó LB con antibióticos de los siguientes cultivos bacterianos:
* Agrobacterium tumefaciens (cepa con plásmido helper) transformada con un plásmido binario que contiene el gen codificante de la proteína de interés. El gen se podrá expresar desde su propio promotor o desde un promotor constitutivo como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y deberá contar con un terminador o secuencia de poliadenilación. El gen puede codificar una proteína de forma aislada, varias, o una proteína de fusión, tanto en su extremo N-terminal como C-terminal. De este modo logramos que nuestra proteína quede unida a una secuencia que la dirija de forma específica a un orgánulo de la célula, que facilite su purificación o seguimiento mediante el uso de anticuerpos, o que permita su localización mediante microscopía de fluorescencia. Este es el caso de las fusiones con proteínas autofluorescentes (GFP, RFP, YFP, BFP, etc...). En los ensayos de colocalización mediante microscopía confocal se inocularán sendos cultivos de Agrobacterium con cada una de las proteínas de fusión que deseemos colocalizar.
* Agrobacterium tumefaciens (cepa con plásmido helper) transformada con un plásmido binario que contiene el gen codificante del inhibidor de silenciamiento de origen viral p19 ó V2.


1.2) Adición de Acetosiringona 200 mM a los cultivos crecidos durante la noche e incubación del cultivo durante 2 ó 3 horas a temperatura ambiente ó a 28ºC  y en agitación. La acetosiringona es un compuesto fenólico que exudan las plantas por las heridas y que funciona como quimioatrayente de A. tumefaciens.

1.3) Recolección de las células mediante centrifugación y suspensión de las mismas en medio de infiltración (MI, formado por Mg Cl 10 mM y MES 10 mM a pH 5,8). 

1.4) Unión de los cultivos de partida de A. tumefaciens de tal modo que la concentración final de cada uno corresponda a una OD600 de 0,3.

1.5) Adición de Acetosiringona 200 mM a la mezcla de cultivos e incubación del cultivo durante 1 hora a temperatura ambiente y sin agitación. 


Pasado el tiempo de incubación procedemos a la infiltración de la mezcla de cultivos de A. tumefaciens en N. benthamiana. En el caso en que se desee observar la variación en el patrón de expresión de la proteína de interés cuando N. benthamiana sufre una infección por una bacteria patógena se añadirá a la mezcla de cultivos el cultivo de la bacteria patógena ajustada a la concentración deseada para la misma antes de la infiltración.

2º) Infiltración de la mezcla de cultivos bacterianos en las hojas de N. benthamiana:



2.1.) Una vez seleccionada una planta sana de N. benthamiana y del tamaño apropiado para nuestro propósito hacemos una pequeña herida con una aguja estéril por el envés de las hojas (ni las más viejas ni las más jóvenes) en las que vayamos a llevar a cabo la infiltración.


2.2) Infiltramos por la herida recién hecha y por el envés de las hojas la mezcla de cultivos con una jeringuilla de 1 ml sin aguja.


La mezcla de cultivos ocupa el apoplasto del área de la hoja que hayamos inoculado.



3º) Recolección de las hojas infiltradas y análisis correspondiente:

Entre los dos o tres días después de la agroinfiltración podemos tener una expresión adecuada de la proteína de interés si bien deberemos chequear previamente en cada caso en qué momento se consigue el nivel de expresión deseado. Al cabo de ese tiempo se puede recolectar el tejido para extraer la proteína o se puede observar la localización de una proteína en el microscopio confocal. En este caso basta con cortar un pequeño fragmento del área de la hoja que ha sido infiltrada y disponerlo en agua entre porta y cubre-objetos. 

Expresión de la proteína de fusión PRO:GFP a los 3 días de la agroinfiltración en hojas de N. benthamiana. Observación realizada en microscopio confocal.




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